ispltaИзвестия Санкт-Петербургской лесотехнической академииIzvestia Sankt-Peterburgskoj lesotehniceskoj akademii2079-43042658-5871СПбГЛТУ10.21266/2079-4304.2023.246.206-220isplta-98Research ArticleЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВОFORESTRYСоздание ДНК-библиотек для высокопроизводительного генотипирования березы карельской и анализ их качестваCreation of DNA libraries for high-throughput genotyping of Karelian birch and analysis of their qualityСафронычеваЕ. Д.SafronychevaE. D.

САФРОНЫЧЕВА Елизавета Дмитриевна – лаборант центра биоинформатики и геномных исследований; Младший научный сотрудник исследовательской лаборатории

194021, Институтский пер., д. 5, лит. У, Санкт-Петербург

194021, Институтский пр., д. 21, Санкт-Петербург

SAFRONYCHEVA Elizaveta D. – research technician at the Centre for Bioinformatics and Genomic Research; Junior researcher of the research laboratory

194021. Institutskiy per. 5. letter U. St. Petersburg

194021. Institutskiy av. 21. St. Petersburg

esafronycheva@mail.ruЛыткинК. Ф.LytkinK. F.

ЛЫТКИН Кирилл Федорович – лаборант центра биоинформатики и геномных исследований

194021, Институтский пер., д. 5, лит. У, Санкт-Петербург

LYTKIN Kirill F. – research technician at the Centre for Bioinformatics and Genomic Research

194021. Institutskiy per. 5. letter U. St. Petersburg

kirill.lytkin@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2444-9502КаржаевД. С.KarzhaevD. S.

КАРЖАЕВ Дмитрий Сергеевич – младший научный сотрудник центра биоинформатики и геномных исследований, аспирант; Младший научный сотрудник исследовательской лаборатории

194021, Институтский пер., д 5, лит. У, Санкт-Петербург

194021, Институтский пр., д. 21, Санкт-Петербург

KARZHAEV Dmitry S. – junior researcher at the Centre for Bioinformatics and Genomic Research, PhD student; Junior researcher of the research laboratory

194021. Institutskiy per. 5. letter U. St. Petersburg

194021. Institutskiy pr. 21. St. Petersburg

karzhaevd@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-2933-4456ВолковВ. А.VolkovV. A.

ВОЛКОВ Владимир Александрович – директор центра биоинформатики и геномных исследований, кандидат биологических наук; Научный сотрудник исследовательской лаборатории

194021, Институтский пер., д 5, лит. У, Санкт-Петербург

194021, Институтский пр., д. 21, Санкт-Петербург

VOLKOV Vladimir. A. – PhD (Biological), Director of the Center for Boinformatics and Genomic Research; Researcher of the research laboratory

194021. Institute per. 5. St. Petersburg

194021. Institutsky per. 21. St. Petersburg

vol-j@mail.ruСанкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт лесного хозяйстваРоссияSt.Petersburg State Forest Technical University; St. Petersburg Forestry Research InstituteRussian FederationСанкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. КироваРоссияSt.Petersburg State Forest Technical UniversityRussian FederationСанкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт лесного хозяйстваРоссияSt.Petersburg State Forest Technical University; Saint-Petersburg forestry research instituteRussian Federation2023200220240246206220Copyright © Сафронычева Е.Д., Лыткин К.Ф., Каржаев Д.С., Волков В.А., 20242024Сафронычева Е.Д., Лыткин К.Ф., Каржаев Д.С., Волков В.А.Safronycheva E.D., Lytkin K.F., Karzhaev D.S., Volkov V.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://izvestiya-lta.spbftu.ru/jour/article/view/98

В статье рассматривается вопрос разработки рабочего лабораторного протокола создания ДНК-библиотек для высокопроизводительного генотипирования березы карельской и приводится анализ качества полученных библиотек. Древесина карельской березы (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti) всегда ценилась за свой необычный и ярко выраженный рисунок годичных колец. Этот материал высоко ценится в производстве и используется в изготовлении мебели, посуды, различных предметов интерьера и декоративных вставок. Из-за сложности определения типа древесины на ранних этапах роста дерева, приходится использовать плантации с большим числом особей. Процесс отбора «карельских» образцов по внешним характеристикам дерева затруднен, так как в значительной степени зависит от знаний и опыта специалиста-селекционера. Сделать отбор «карельских» форм более точным и быстрым можно с помощью генетических маркеров, которые будут объективно отражать изменения в геноме, ассоциированные с образованием узорчатой древесины. Выявление генетических локусов, определяющих признак узорчатоcть древесины у сеянцев на ранних стадиях развития, помогло бы в перспективе создавать «чистые» плантации карельской березы, без примеси деревьев с обычной древесиной. Генетические маркеры позволяют более точно отбирать «карельские» формы, исключая деревья с обычной древесиной. Для разработки таких молекулярных маркеров необходимо выявить мутации в генах карельской березы, которые отличают ее от березы повислой и сцеплены с наследованием «узорчатой» древесины. Для поиска мутаций может быть использована технология высокопроизводительного генотипирования на основе секвенирования (Genotyping By Sequencing, GBS). Одним из вариантов GBS является технология прочтения коротких последовательностей ДНК, прилежащих к определенным сайтам рестрикции (RADseq, Restriction site associated DNA sequencing). Разработка рабочего лабораторного протокола создания RADseq библиотек является ключевым этапом проектов по высокопроизводительному генотипированию. Целью настоящего исследования является описание протокола приготовления RADseq библиотеки на материале 12 образцов ДНК березы карельской, а также анализ качества полученных прочтений фрагментов ДНК по результатам секвенирования созданной библиотеки на приборе Illumina HiSeq2500. Результаты проведенного анализа показали, что использованный протокол позволяет получать из ДНК листьев березы библиотеки для секвенирования хорошего качества. Это позволяет переходить далее к следующим этапам анализа – выравнивания прочтений на референсную последовательность и поиск SNP-маркеров.

The article discusses the development of a practical laboratory protocol for creating DNA libraries for high-throughput genotyping of Karelian birch. Karelian birch wood (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti) has always been valued for its unique and distinctly patterned annual rings. This material is highly prized in manufacturing and is used in furniture, tableware, various interior items, and decorative inlays. Due to the complexity of identifying the type of wood at the early stages of tree growth, plantations with a large number of individuals have to be used. The process of selecting «Karelian» samples based on the external characteristics of the tree is challenging because it largely depends on the knowledge and experience of a breeding specialist. Making the selection of «Karelian» forms more precise and faster can be achieved with genetic markers that objectively reflect changes in the genome associated with the formation of patterned wood. Identifying the genetic loci that determine the «wood patterning» trait in seedlings at early stages of development would help in the future to create «pure» Karelian birch plantations without the presence of trees with regular wood. Genetic markers allow for a more precise selection of «Karelian» forms, excluding trees with regular wood. To develop such molecular markers, it is necessary to identify mutations in Karelian birch genes that distinguish it from pendulous birch and are linked to the inheritance of «patterned» wood. The technology of high-throughput genotyping based on sequencing (Genotyping By Sequencing, GBS) can be used to search for mutations. One of the GBS variants is the technology of reading short DNA sequences adjacent to specific restriction sites (RADseq, Restriction site-associated DNA sequencing). The development of a working laboratory protocol for creating RADseq libraries is a key step in high-throughput genotyping projects. The goal of this research is to describe the protocol for preparing a RADseq library using 12 Karelian birch DNA samples, as well as to analyze the quality of the obtained DNA fragment readings from the sequencing of the created library using the Illumina HiSeq2500 instrument. The results of the analysis showed that the protocol used allows for obtaining high-quality libraries from birch leaf DNA. This enables the progression to the next stages of analysis, including aligning reads to the reference sequence and searching for SNP markers.

береза карельскаягенетическая библиотекаанализ качества генетической библиотекиприготовление библиотекRadSeqkarelian birchgenetic libraryanalysis of the quality of the genetic librarypreparation of librariesRadSeqИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-16-00096, https://rscf.ru/project/22-16-00096/ReferencesАлексеева А.И. Отличие анатомического строения древесины карельской березы от строения древесины березы бородавчатой // Тр. Всесоюз. заоч. лесотехн. ин-та. 1964. №. 8. С. 159–163.Alekseeva A.I. The difference between the anatomical structure of Karelian birch wood and the structure of warty birch wood. Tr. All-Union. part-time. forestry engineering. in-ta, 1964, no. 8, pp. 159–163. (In Russ.)Булыгин Н.Е. Дендрология. 2-е изд.-е, перераб. и доп. Агропромиздат. Ленингр. отд-е, 1991. 352 с.Bulygin N.E. Dendrology. – 2nd edition, revised and supplemented. L.: Agropromizdat. Leningr. otd-nie, 1991. 352 p. (In Russ.)Ветчинникова Л.В. Карельская береза и другие редкие представители рода Betula L. / отв. ред. А.Ф. Титов. Ин-т леса Карельского научного центра РАН. М.: Наука, 2005. 269 с.FastQC Manual // University of Missouri Genomics Technology Core URL: https://dnacore.missouri.edu/PDF/FastQC_Manual.pdf (дата обращения: 01.08.2023).FastQC Manual // University of Missouri Genomics Technology Core URL: https://dnacore.missouri.edu/PDF/FastQC_Manual.pdf (accessed August 01, 2023).Peterson B.K. et al. Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species. PloS one, 2012, vol. 7, no. 5, p. e37135.Peterson B.K. et al. Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species // PloS one. 2012. Vol. 7, no. 5. P. e37135.Potokina E.K. et al. Genomic introgressions of immune Vitis rotundifola Michx into Russian grapevine germplasm revealed by RADseq genotyping. Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology, 2021, pp. 177–177.Potokina E.K. et al. Genomic introgressions of immune Vitis rotundifola Michx into Russian grapevine germplasm revealed by RADseq genotyping // Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology. 2021. С. 177–177.Rahimah A.B. et al. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA. J. Oil Palm Res., 2006, vol. 18, pp. 296–304.Rahimah A.B. et al. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA // J. Oil Palm Res. 2006. Vol. 18. P. 296–304.Salojärvi J. et al. Genome sequencing and population genomic analyses provide insights into the adaptive landscape of silver birch. Nature genetics, 2017, vol. 49, no. 6, pp. 904–912.Salojärvi J. et al. Genome sequencing and population genomic analyses provide insights into the adaptive landscape of silver birch // Nature genetics. 2017. Vol. 49, no. 6. P. 904–912.Vetchinnikova L.V. Karelian birch and other rare representatives of the genus Betula L. [ed. by A.F. Titov]; And n-t forests of the Karelian. (In Russ.)Zhigunov A.V. et al. Development of F1 hybrid population and the high-density linkage map for European aspen (Populus tremula L.) using RADseq technology // BMC plant biology. 2017. Vol. 17, no. 1. P. 1–12.Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. M.: Nauka, 2005. 269 p.Zhigunov A.V. et al. Development of F1 hybrid population and the high-density linkage map for European aspen (Populus tremula L.) using RADseq technology. BMC plant biology. 2017, vol. 17, no. 1, pp. 1–12.Zhigunov A.V. et al. Development of F1 hybrid population and the high-density linkage map for European aspen (Populus tremula L.) using RADseq technology. BMC plant biology. 2017, vol. 17, no. 1, pp. 1–12.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.