Создание ДНК-библиотек для высокопроизводительного генотипирования березы карельской и анализ их качества

В статье рассматривается вопрос разработки рабочего лабораторного протокола создания ДНК-библиотек для высокопроизводительного генотипирования березы карельской и приводится анализ качества полученных библиотек. Древесина карельской березы (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti) всегда ценилась за свой необычный и ярко выраженный рисунок годичных колец. Этот материал высоко ценится в производстве и используется в изготовлении мебели, посуды, различных предметов интерьера и декоративных вставок. Из-за сложности определения типа древесины на ранних этапах роста дерева, приходится использовать плантации с большим числом особей. Процесс отбора «карельских» образцов по внешним характеристикам дерева затруднен, так как в значительной степени зависит от знаний и опыта специалиста-селекционера. Сделать отбор «карельских» форм более точным и быстрым можно с помощью генетических маркеров, которые будут объективно отражать изменения в геноме, ассоциированные с образованием узорчатой древесины. Выявление генетических локусов, определяющих признак узорчатоcть древесины у сеянцев на ранних стадиях развития, помогло бы в перспективе создавать «чистые» плантации карельской березы, без примеси деревьев с обычной древесиной. Генетические маркеры позволяют более точно отбирать «карельские» формы, исключая деревья с обычной древесиной. Для разработки таких молекулярных маркеров необходимо выявить мутации в генах карельской березы, которые отличают ее от березы повислой и сцеплены с наследованием «узорчатой» древесины. Для поиска мутаций может быть использована технология высокопроизводительного генотипирования на основе секвенирования (Genotyping By Sequencing, GBS). Одним из вариантов GBS является технология прочтения коротких последовательностей ДНК, прилежащих к определенным сайтам рестрикции (RADseq, Restriction site associated DNA sequencing). Разработка рабочего лабораторного протокола создания RADseq библиотек является ключевым этапом проектов по высокопроизводительному генотипированию. Целью настоящего исследования является описание протокола приготовления RADseq библиотеки на материале 12 образцов ДНК березы карельской, а также анализ качества полученных прочтений фрагментов ДНК по результатам секвенирования созданной библиотеки на приборе Illumina HiSeq2500. Результаты проведенного анализа показали, что использованный протокол позволяет получать из ДНК листьев березы библиотеки для секвенирования хорошего качества. Это позволяет переходить далее к следующим этапам анализа – выравнивания прочтений на референсную последовательность и поиск SNP-маркеров.

1. Алексеева А.И. Отличие анатомического строения древесины карельской березы от строения древесины березы бородавчатой // Тр. Всесоюз. заоч. лесотехн. ин-та. 1964. №. 8. С. 159–163.

2. Булыгин Н.Е. Дендрология. 2-е изд.-е, перераб. и доп. Агропромиздат. Ленингр. отд-е, 1991. 352 с.

3. Ветчинникова Л.В. Карельская береза и другие редкие представители рода Betula L. / отв. ред. А.Ф. Титов. Ин-т леса Карельского научного центра РАН. М.: Наука, 2005. 269 с.

4. FastQC Manual // University of Missouri Genomics Technology Core URL: https://dnacore.missouri.edu/PDF/FastQC_Manual.pdf (accessed August 01, 2023).

5. Peterson B.K. et al. Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species // PloS one. 2012. Vol. 7, no. 5. P. e37135.

6. Potokina E.K. et al. Genomic introgressions of immune Vitis rotundifola Michx into Russian grapevine germplasm revealed by RADseq genotyping // Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology. 2021. С. 177–177.

7. Rahimah A.B. et al. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA // J. Oil Palm Res. 2006. Vol. 18. P. 296–304.

8. Salojärvi J. et al. Genome sequencing and population genomic analyses provide insights into the adaptive landscape of silver birch // Nature genetics. 2017. Vol. 49, no. 6. P. 904–912.

9. Zhigunov A.V. et al. Development of F1 hybrid population and the high-density linkage map for European aspen (Populus tremula L.) using RADseq technology // BMC plant biology. 2017. Vol. 17, no. 1. P. 1–12.